Sangue

Communications Biology volume 6, Número do artigo: 517 (2023) Citar este artigo

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Dermanyssus gallinae é um ácaro hematófago que parasita aves silvestres e de criação. Seu processamento de sangue notavelmente rápido, juntamente com a capacidade de se alimentar de sangue durante a maioria dos estágios de desenvolvimento, torna esse ácaro uma praga altamente debilitante. Para identificar adaptações específicas para a digestão de uma dieta rica em hemoglobina, construímos e comparamos transcriptomas de estágios de fome e alimentados com sangue do parasita e identificamos transcritos enriquecidos no intestino médio. Observamos que os transcritos do intestino médio que codificam proteases de cisteína foram regulados positivamente com uma refeição de sangue. Mapeando todo o aparato proteolítico, observamos uma redução no conjunto de proteases de cisteína, faltando homólogos para Catepsina B e C. Identificamos e analisamos filogeneticamente três transcritos distintos que codificam vitelogeninas que facilitam a capacidade reprodutiva dos ácaros. Também mapeamos totalmente as transcrições para a biossíntese do heme e o sistema baseado em ferritina de armazenamento de ferro e tráfego intertecido. Além disso, identificamos transcritos que codificam proteínas envolvidas na sinalização imune (vias Toll e IMD) e atividade (defensinas e proteínas contendo tioéster), RNAi e canalização iônica (com alvos para acaricidas comerciais como Fluralaner, Fipronil e Ivermectina). As sequências virais foram filtradas das leituras do Illumina e descrevemos, em parte, o RNA-viroma de D. gallinae com a identificação de um novo vírus, Red mite quaranjavirus 1.

Os ácaros Dermanyssus são ectoparasitas hematófagos de aves1. O ácaro vermelho das aves (D. gallinae) é uma praga global em aviários de poedeiras tanto para a produção doméstica quanto para a produção intensiva de ovos2,3,4, parte de um mercado global importante e em constante crescimento5. Os ácaros D. gallinae têm um ciclo de vida muito curto, indo do estágio juvenil ao adulto maduro em uma semana. A necessidade de se alimentar de sangue na maioria dos estágios de desenvolvimento e a rápida dinâmica reprodutiva tornam D. gallinae uma praga altamente irritante e problemática. Durante a alimentação sanguínea, os ácaros D. gallinae podem transmitir vários patógenos animais importantes para seus hospedeiros6, incluindo alguns que são zoonóticos7. Embora um grande número de vírus e bactérias tenha sido encontrado associado a D. gallinae, sua capacidade de atuar como vetor ou reservatório foi comprovada experimentalmente para apenas alguns patógenos8,9,10. Isso é especialmente alarmante para a transmissão de Salmonella spp.10, causando salmonelose associada ao ovo e tifo aviário11, bem como a disseminação do vírus da influenza aviária A12. D. gallinae também tem sido associada a várias outras espécies bacterianas e virais, com comprovação aguardando confirmação experimental de sua capacidade vetorial2,10,13,14.

Apesar do conhecimento geral do impacto global da infestação de ácaros no bem-estar das galinhas na produção de ovos, nossa compreensão dos processos moleculares que permitem alimentação sanguínea rápida e repetitiva, digestão do sangue, desenvolvimento e reprodução permanece escassa. Estudos transcriptômicos anteriores descreveram transcriptomas de corpos inteiros de ácaros D. gallinae, principalmente em um estágio de desenvolvimento ou modo específico de alimentação15,16,17,18. Para aumentar ainda mais nosso conhecimento, buscamos identificar transcritos específicos do intestino médio que codificam proteínas que são essenciais para o sucesso da alimentação e digestão do sangue. Para conseguir isso, comparamos transcriptomas recém-sequenciados e montados, com seleção subsequente para transcritos enriquecidos em ácaros alimentados com sangue em vez de ácaros não alimentados, com clara expressão específica do intestino. Atenção especial foi dada aos processos inerentes aos sugadores de sangue bem-sucedidos, incluindo digestão enzimática de proteínas do sangue do hospedeiro, biologia do heme e do ferro, vitelogênese e imunidade inata. Os dados de RNA-seq foram então verificados por RT-qPCR em conjuntos de cDNA preparados a partir de múltiplas réplicas biológicas independentes. Além disso, complementamos a análise de dados de RNA-seq com vários bioensaios, nos quais inibidores de pequenas moléculas foram introduzidos no ácaro por alimentação de membrana ex vivo ou microinjeção em sua hemocele, a fim de entender a importância de moléculas e vias selecionadas. Além disso, as leituras de Illumina de origem viral foram filtradas e usadas para uma montagem parcial do viroma de RNA do ácaro.

54 M reads with Phred Scores of Q30 ≥ 93.90% were obtained, and these were assembled into 85,117 contigs (Supplementary Table S1). Following their annotation, bacterial contaminants were removed (Supplementary Table S2). As D. gallinae mites were fed chicken blood, consisting of nucleated white and red cells, 4% of total reads were of chicken origin, out of which (79%) were found, as expected, in the midgut transcriptome (Supplementary Fig. S1). The identified chicken sequences were filtered out and excluded from the following analyses. A total of 18,101 D. gallinae-specific contigs were deposited at the NCBI server as BioProject PRJNA597301 and Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 and are accessible through NCBI BLAST of the TSA database. The contigs are also listed in a hyper-linked Excel sheet (see "Data availability") with available encoded predicted protein characteristics, annotations of assembled contigs according to a particular database, differential expression statistics, and predicted cellular processes. To assess the completeness of the transcriptome, we ran a BUSCO analysis of the proteome, the result of which exhibited a yield of 91.8% complete BUSCOs. The heat map generated from D. gallinae-specific contigs clearly indicated differences between transcriptomes of immature and adult stages and also highlighted differences in the abundance of transcripts in blood-fed over unfed mites (Supplementary Fig. S1)./p>16× FPKM values over unfed protonymphs and with transcripts of FPKM ≥ 1 in midguts. b The bar graph shows protein classes encoded by individual transcripts enriched by blood-feeding. Transcripts were sorted according to encoded protein class. The number of transcripts from each subclass and their FPKM values are shown. c The table shows top differentially expressed transcripts (DET) enriched, >16× FPKM values, in transcriptomes of blood-fed protonymphs (FP) over transcriptomes of unfed protonymphs (UP). Individual accession IDs are available in Supplementary Table S3. c’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (c). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of unfed and blood-fed mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. d The table shows DETs enriched in transcriptomes of midguts over transcriptomes of whole bodies, with filters applied: Eval < e−60, coverage ≥ 90%, FPKMAdults ≥ 2. Individual accession IDs are available in Supplementary Table S4. d’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (d). Data were obtained from cDNA sets synthesised from at least four independent RNA isolates of adult females and micro-dissected midguts of adult females (n ≥ 4) and normalised to ef1α. Means and SEMs are shown. t-Test analyses: *p = 0.05–0.01; **p = 0.01–0.001; ***p = 0.0008; ****p < 0.0001; n.s. not significant. For the source data behind the graphs, see Supplementary Data S1./p>

16× FPKM values in the transcriptome of adults over transcriptomes of both mite juvenile stages, protonymphs and deutonymphs; and E-value < e−80; protein IDs are available as Supplementary Table S7. b’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (b). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of adult and juvenile mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. For the source data behind the graph, see Supplementary Data S1. FP fed protonymphs, FD fed deutonymphs. c Maximum likelihood phylogeny of 94 arthropod vitellogenin amino acid sequences showing the positioning of three D. gallinae vitellogenin homologues within the Vg1 and Vg2 lineages. Crustacean vitellogenins were used as an outgroup. Nodal supports at the main nodes are represented by maximum likelihood bootstrap values and Bayesian inference posterior probabilities, respectively. For simplification, the homologues from non-parasitiform taxa were collapsed into triangles; numbers inside the triangle indicate the number of sequences included in each clade. For GenBank accession numbers, see Supplementary Table S8./p>

16 fold over its FPKM values in the transcriptome of FP, and at the same time, in the transcriptome of fed deutonymphs (see "Data availability"). In order to list transcripts enriched in the transcriptome of fed over UP, only transcripts with clear annotations (E-value < e−100), coverage > 10%, and FPKM in FP > 5 were considered. The transcripts were then listed according to the highest fed/unfed ratios./p>

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