Vírus

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 4101 (2023) Citar este artigo

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A expressão e purificação da miosina são importantes para insights mecanísticos sobre a função normal e mudanças induzidas por mutações. Este último é particularmente importante para a miosina II do músculo estriado, onde as mutações causam várias doenças debilitantes. No entanto, a cadeia pesada dessa miosina é difícil de expressar e o protocolo padrão, usando células C2C12, depende da infecção viral. Isso é demorado e trabalhoso e está associado a demandas de infraestrutura e riscos biológicos, limitando o uso generalizado e dificultando a geração rápida de uma ampla gama de mutações. Desenvolvemos aqui um método livre de vírus para superar esses desafios. Usamos este sistema para transfectar células C2C12 com o domínio motor da cadeia pesada de miosina cardíaca humana. Depois de otimizar as condições de transfecção celular, cultivo e colheita, caracterizamos funcionalmente a proteína expressa, co-purificada com cadeias leves essenciais e regulatórias murinas. A velocidade de deslizamento (1,5–1,7 µm/s; 25 °C) no ensaio de motilidade in vitro, bem como a atividade catalítica ativada por actina máxima (kcat; 8–9 s-1) e a concentração de actina para metade da atividade máxima (KATPase; 70 –80 µM) foram semelhantes aos encontrados anteriormente usando infecção baseada em vírus. Os resultados devem permitir novos tipos de estudos, por exemplo, triagem de uma ampla gama de mutações a serem selecionadas para posterior caracterização.

Miosinas são motores moleculares que desenvolvem força e movimento interagindo com filamentos de actina em um processo cíclico impulsionado pela renovação do ATP. Esse processo é a base para uma variedade de funções importantes, como contração muscular, motilidade/desenvolvimento de força de células não musculares, transporte de carga intracelular e sinalização celular1. Até 79 classes2 foram recentemente identificadas na superfamília da miosina. Todos eles são construídos em torno de uma cadeia pesada de miosina (MHC; ~ 90-250 kD) com sítio de ligação de actina, sítio de ATPase catalítico e outros elementos importantes para a função motora, bem como para a formação de filamentos e ligação de carga. Além disso, cadeias leves, com funções estabilizadoras, moduladoras e reguladoras, estão ligadas a cada uma das cadeias pesadas. Para obter informações sobre os mecanismos básicos da função motora da miosina, mas também para estudos detalhados de mutações causadoras de doenças, é importante ser capaz de expressar e purificar todos os componentes proteicos mencionados.

O sistema mais utilizado para expressar e purificar proteínas depende de E. coli como hospedeiro de expressão, resultando em altos rendimentos de purificação (se o produto de expressão for solúvel), bem como mão de obra e custo-benefício3. No entanto, o sistema procariótico carece de maquinário celular completo para auxiliar o dobramento apropriado e a modificação pós-traducional de proteínas eucarióticas. Enquanto a expressão e purificação de cadeias leves de miosina funcionais é possível usando E. coli, as cadeias pesadas de miosina (MHCs) não podem ser produzidas na forma funcional usando este sistema4. Portanto, uma variedade de sistemas eucarióticos de expressão e purificação baseados em Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, células de insetos9,10,11,12,13,14 e células de mamíferos15,16 foram desenvolvidas. Embora esses sistemas funcionem bem para a produção de uma variedade de classes de MHC, eles tiveram sucesso limitado com miosinas de músculos estriados de vertebrados17,18,19, provavelmente devido à falha em incluir toda a maquinaria de dobragem de proteínas das células musculares. Embora vários trabalhos tenham identificado a UNC-45 como uma chaperona envolvida no dobramento da miosina e na montagem do sarcômero20,21,22,23,24, parece haver outros fatores envolvidos, como Hsp70/Hsp9025 e chaperonina26. De acordo com essa visão, Winkelmann e colegas apresentaram evidências de que o dobramento apropriado de miosinas musculares estriadas em uma forma totalmente funcional ocorre apenas em um ambiente semelhante a um músculo diferenciado, ou seja, miotubos musculares27,28,29. Com base nessa ideia, mioblastos C2C12 de camundongos que se diferenciam em miotubos foram introduzidos como uma linhagem de células hospedeiras de expressão de escolha27. Os mioblastos foram transfectados com plasmídeos portadores de MHC de músculo esquelético embrionário de galinha sob um promotor, o que garante que a expressão de MHC comece apenas após a diferenciação em miotubos. O rendimento da purificação foi suficiente para avaliar a função da miosina com base na atividade da ATPase ativada por actina. A geração de linhas celulares estáveis27 nesta versão inicial do sistema de purificação e expressão baseado em C2C12 ("sistema baseado em C2C12" a partir daqui) oferece rendimentos de purificação relativamente altos com fluxo de trabalho econômico e de tempo eliminando ciclos de transfecção. No entanto, o desenvolvimento estável da linha celular pode exigir até 12 meses30 e não seria a melhor abordagem para examinar várias construções diferentes (por exemplo, mutações pontuais) de uma miosina específica. Em contraste, a expressão transitória oferece a vantagem de um tempo de desenvolvimento curto e uma rápida renovação30. Assim, o sistema baseado em C2C12 foi posteriormente modificado utilizando a expressão transiente de adenovírus para introduzir e estudar o impacto de mutações pontuais de miosina associadas a cardiomiopatias hipertróficas31. O mesmo sistema foi ainda otimizado por Resnicow et al.32 para permitir a produção de quantidades suficientes de MHCs para análise cinética transiente de isoformas de miosina cardíaca e esquelética humana recombinante33,34,35. Digno de nota, atividades de ATPase consideravelmente mais altas foram alcançadas tanto para o tipo selvagem (WT) quanto para a miosina β-cardíaca mutante nesses estudos do que em um relatório anterior19, onde mutantes de miosina β-cardíaca humana foram expressos e purificados a partir de células de insetos. Atualmente, a infecção baseada em adenovírus de miotubos C2C12 permite a produção de quantidades suficientes de miosinas musculares estriadas adequadamente dobradas e funcionais (construções semelhantes a S1 e HMM) para estudos funcionais críticos, entre outros, ensaios de motilidade in vitro e cinética de solução bioquímica transitória34,36.