Fumarato induz a liberação vesicular de mtDNA para conduzir a imunidade inata

Nature volume 615, páginas 499–506 (2023) Cite este artigo

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Mutações na fumarato hidratase (FH) causam leiomiomatose hereditária e carcinoma de células renais1. A perda de HF no rim desencadeia várias cascatas de sinalização oncogênica por meio do acúmulo do oncometabólito fumarato2. No entanto, embora as consequências a longo prazo da perda de HF tenham sido descritas, a resposta aguda ainda não foi investigada. Aqui, geramos um modelo de camundongo induzível para estudar a cronologia da perda de FH no rim. Mostramos que a perda de FH leva a alterações precoces da morfologia mitocondrial e à liberação de DNA mitocondrial (mtDNA) no citosol, onde desencadeia a ativação da sintase cíclica de GMP-AMP (cGAS) – estimulador de genes de interferon (STING) – TANK-binding kinase 1 (TBK1) e estimula uma resposta inflamatória que também é parcialmente dependente do gene I induzível por ácido retinóico (RIG-I). Mecanicamente, mostramos que esse fenótipo é mediado pelo fumarato e ocorre seletivamente através de vesículas derivadas da mitocôndria de uma maneira que depende da classificação da nexina 9 (SNX9). Estes resultados revelam que níveis aumentados de fumarato intracelular induzem uma remodelação da rede mitocondrial e a geração de vesículas derivadas da mitocôndria, o que permite a liberação de mtDNA no citosol e subsequente ativação da resposta imune inata.

A fumarato hidratase (FH), uma enzima metabólica do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) que catalisa a conversão reversível do fumarato em malato, foi identificada como um supressor tumoral de boa-fé2. A perda de HF predispõe à leiomiomatose hereditária e ao carcinoma de células renais (HLRCC), síndrome caracterizada por uma forma agressiva de câncer renal. Uma marca registrada de células e tumores com deficiência de FH é o acúmulo aberrante de fumarato3, que demonstrou conduzir a transformação maligna e a progressão do tumor por meio da ativação de uma série de cascatas oncogênicas2. No entanto, quando analisadas em tumores ou outros modelos celulares, todas essas cascatas de sinalização já estão ativadas simultaneamente e provavelmente estão interligadas, o que dificulta a elucidação de sua hierarquia, cross-talk e contribuição causal para a doença.

Aqui, geramos um modelo de camundongo transgênico induzível para investigar a cronologia da perda de Fh1, o ortólogo do camundongo da FH humana, no rim adulto. Ao cruzar uma cepa Fh1fl/fl previamente gerada4 com camundongos que contêm uma recombinase Cre induzida por tamoxifeno expressa ubiquamente no locus5 Rosa26, obtivemos uma cepa Fh1fl/fl induzível por tamoxifeno (Fig. 1a). O tratamento de camundongos Fh1fl/fl com tamoxifeno resultou na excisão eficiente dos éxons 3 e 4 de Fh1 (doravante denominados Fh1−/−), em comparação com a cepa de controle (Fh1+/+) (Fig. 1b e Dados Estendidos Fig. 1a,b) . A perda de FH causa alterações metabólicas profundas, incluindo o acúmulo intracelular aberrante de argininosuccinato6 e de produtos da reação pela qual o fumarato é adicionado aos grupos tiol da cisteína livre e aos grupos tiol das proteínas7, gerando S-(2-succinil)cisteína (2SC) e proteínas succinadas, respectivamente. Ambas as reações tamponam o excesso de produção de fumarato, que eventualmente ocorre quando esses e outros sistemas tamponantes atingem sua capacidade (Dados Estendidos, Fig. 1c). Observamos um aumento precoce de 2SC no dia 5, seguido por um aumento de todos esses marcadores metabólicos, incluindo fumarato, no dia 10 nos rins Fh1−/− (Fig. 1c). Macroscopicamente, não houve grandes diferenças morfológicas entre o tipo selvagem e os rins deficientes em Fh1 (Fig. 1d).

a, Estratégia de edição do genoma para gerar alelos knockout Fh1 induzíveis. Camundongos Rosa26-Cre-ERT2 carregam o transgene Cre recombinase responsivo ao tamoxifeno a jusante do promotor Rosa265. Camundongos Fh1fl/fl13 contêm dois sítios loxP flanqueando os éxons 3 e 4 de Fh1. A injeção intraperitoneal de tamoxifeno no camundongo adulto induz a translocação nuclear da proteína de fusão Cre-ERT2 expressa ubiquamente, resultando na excisão do fragmento genômico localizado entre os sítios loxP para gerar alelos nulos Fh1 (Fh1−/−). Camundongos com cerca de 90 dias de idade são tratados com tamoxifeno e os rins são coletados para análise no dia 5 e no dia 10 após a injeção. b, níveis de expressão de mRNA de Fh1 em rins de camundongos adultos de controle de tipo selvagem (Fh1+/+) e deficientes em Fh1 (Fh1−/−), medidos por qRT–PCR. c, Abundância de metabólitos (intensidade iônica de pico normalizada, unidades arbitrárias (AU)) em Fh1+/+ e Fh1−/− rim de camundongo adulto medido por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). d, coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de rim de camundongo adulto Fh1+/+ e Fh1−/− no dia 10 após a indução. Barras de escala, 100 μm. e, Volcano plots do GSEA, destacando as vias diferencialmente reguladas em Fh1−/− versus Fh1+/+ tecido renal no dia 10 após a indução. FDR, taxa de descoberta falsa; NES, pontuação de enriquecimento normalizado. f, mapa de calor mostrando genes relacionados à inflamação regulados positivamente em tecido renal Fh1−/− versus Fh1+/+ no dia 5 e no dia 10 após a indução (os glóbulos brancos significam que não há diferença entre os dois grupos). g, níveis de expressão de ISGs em tecido renal Fh1−/− versus Fh1+/+ no dia 5 e dia 10 após a indução, medidos por qRT-PCR. Os dados são média ± sem b,c,g, n = mínimo de 8 camundongos em cada grupo, teste t de Student corrigido para comparações múltiplas com o método Holm–Sidak.